?近年來,CRISPR/Cas技術飛速發展,基于該技術發展的分子檢測方法具有快速、靈敏、特異、廉價等特性,已廣泛應用于生命科學領域,尤其在病原體檢測領域發展迅速。目前用于呼吸道病原體檢測的主要有CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系統。
CRISPR/Cas13檢測系統,張鋒等開發了一種基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術,為SARS-CoV-2提供了快速準確的診斷方法。通過使用合成的SARS-CoV-2的RNA片段,設計并檢測了2個可識別SARS CoV-2特征的sgRNA,激活Cas13酶活性,切割報告分子,產生信號 。該技術最后需要將試紙條浸入反應體系中,通過辨識條帶位置的不同來確認是否感染SARS-CoV-2。
諾貝爾獎獲得者Doudna等報道了一種CRISPR/Cas13a和手機直接檢測新冠病毒的RNA的方法 ,這是一種簡便且便攜的檢測方法,實現從采樣到檢測的一體化。該裝置通用小型精簡的手機攝像頭進行熒光測試。此外,因為手機攝像頭具有高靈敏度、強連接性以及GPS和數據處理功能,所以這是一種可以應用到資源匱乏地區的實用工具,有助于即時檢測 。
在CRISPR/Cas12檢測系統,美國加州大學研究人員開發了一種基于CRISPR/Cas12的快速檢測SARS-CoV-2的方法,稱為DETECTR (DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter) 的病毒傳感器。該方法具有與qRT-PCR相當的準確性,具有無需加熱循環、快速、單核苷酸靶標特異性、無需復雜的實驗室設備等優勢 。
此外,復旦大學牽頭的研究團隊報道了一種基于CRISPR/Cas12的“多相復式非連續生產法”用于檢測SARS-CoV-2,俗稱“一鍋法” (opv CRISPR) ,是將逆轉錄環介導等溫擴增技術 (RT-LAMP) 及Cas12a剪切整合到一個反應體系中完成檢測 。在SARS-CoV-2潛在感染的臨床樣本的檢測中,用opv CRISPR方法得到的結果和中國疾病預防控制中心批準的RT-PCR的檢測結果達到100%的一致。這種“一鍋法”的形式,可以完全避免擴增子的污染,實驗操作步驟也被大大簡化,具有很好的臨床應用前景 。
雖然基于CRISPR/Cas的檢測技術發展迅速,但是仍然存在一些障礙和局限性需要研究解決,首先受到PAM序列特點的影響,sg RNA設計的靈活性有限,設計相對復雜;其次CRISPR/Cas 系統識別目標位點以外的其他位點,產生“脫靶”效應,導致檢測結果出現假陽性;因此,除了對現有CRISPR/Cas的診斷技術繼續優化外,仍需發現、發展新型的CRISPR/Cas診斷系統,或與其他方法進行整合以提高應用的普適性,從而確保其具有良好的臨床適用性。
(審核編輯: 諾謹)
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